摘要

彌漫性軸索損傷（Diffuse Axonal Injury, DAI）是重型顱腦創傷中致殘率和死亡率極高的病理類型，其早期診斷和預后評估缺乏特異性生物標志物。本研究采用iTRAQ（相對和絕對定量同位素標記）聯合液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）技術，對DAI患者及對照組的腦脊液/血清樣本進行定量蛋白質組學分析，篩選差異表達蛋白，并通過加權基因共表達網絡分析（WGCNA）、蛋白-蛋白互作（PPI）網絡及功能富集分析構建聚類網絡，鑒定與DAI發生發展密切相關的候選生物標志物。研究結果為DAI的分子機制解析及臨床診斷標志物的開發提供了重要依據。

1. 引言

彌漫性軸索損傷是創傷性腦損傷（TBI）的一種嚴重亞型，主要由旋轉加速-減速剪切力導致神經元軸索廣泛損傷。DAI患者常表現為持續昏迷，且常規影像學檢查（CT/MRI）在早期往往陰性，臨床診斷高度依賴醫師經驗，缺乏客觀的分子指標。因此，尋找高靈敏度、高特異性的DAI生物標志物具有重要的臨床價值。

iTRAQ技術作為一種高通量定量蛋白質組學方法，可在一次實驗中同時比較多達8種不同樣本的蛋白質表達豐度，具有標記效率高、定量準確、重復性好的優勢，已廣泛應用于神經系統疾病生物標志物的篩選。單純依賴差異倍數和P值篩選標志物易忽略蛋白間的協同變化及網絡調控關系。聚類網絡分析（如WGCNA和PPI網絡）可從系統生物學層面揭示蛋白模塊與臨床表型的關聯，提高標志物的可信度。

2. 材料與方法

2.1 樣本收集

選取重度顱腦創傷患者（DAI組，n=30）及健康對照（n=30）的腦脊液或外周血樣本。DAI診斷依據臨床特征、GCS評分及MRI影像學表現（SWI序列顯示彌漫性微出血灶）。所有樣本采集后立即離心分裝，-80°C保存。

2.2 蛋白提取與iTRAQ標記

樣本經裂解、還原烷基化、胰蛋白酶酶切后，采用8標iTRAQ試劑盒進行標記。各組樣本等量混合后，經強陽離子交換色譜（SCX）分級，再進行LC-MS/MS分析（Orbitrap Fusion Lumos質譜儀）。

2.3 數據處理與差異蛋白篩選

原始數據經Proteome Discoverer軟件檢索UniProt人類數據庫，篩選標準為：可信度≥95%，至少包含2個獨特肽段，差異倍數（FC）>1.5或<0.67，且P<0.05。

2.4 聚類網絡構建

• WGCNA分析：將差異蛋白表達量導入R語言WGCNA包，構建共表達網絡，識別與DAI臨床評分（GCS、Rotterdam CT評分）顯著相關的模塊。
• PPI網絡：通過STRING數據庫構建蛋白互作網絡，Cytoscape軟件進行可視化及Hub基因篩選（MCC、Degree算法）。
• 功能富集：使用DAVID和Metascape進行GO和KEGG通路富集分析。

3. 結果

3.1 差異表達蛋白鑒定

共鑒定到6,842個可信蛋白，其中DAI組相較對照組顯著上調蛋白217個，下調蛋白184個。上調蛋白包括神經絲輕鏈（NFL）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、S100B、髓鞘堿性蛋白（MBP）等；下調蛋白涉及突觸囊泡循環、線粒體氧化磷酸化相關蛋白。

3.2 共表達網絡與臨床關聯

WGCNA識別出12個共表達模塊。其中，turquoise模塊（包含1,024個蛋白）與GCS評分呈顯著負相關（r=-0.72, P=1.3e-8），brown模塊（687個蛋白）與Rotterdam CT評分正相關（r=0.65, P=4.1e-6）。turquoise模塊富集于軸索運輸、突觸信號和細胞骨架重構通路，其核心Hub蛋白為NEFL、NEFM、MAPT和UCHL1。

3.3 PPI網絡與Hub蛋白

PPI網絡包含389個節點和2,114條邊。通過MCC算法篩選出前15個Hub蛋白，包括NEFL、NEFM、GFAP、S100B、ENO2、SYN1、GAPDH、ATP5B等。這些Hub蛋白主要富集于神經退行性疾病通路、PI3K-Akt信號通路及氧化磷酸化通路。

3.4 候選生物標志物組合

將WGCNA核心模塊中的Hub蛋白與PPI網絡Hub蛋白取交集，獲得7個重疊蛋白：NEFL、NEFM、GFAP、S100B、UCHL1、ENO2和SYN1。受試者工作特征（ROC）曲線分析顯示，這7個蛋白聯合診斷DAI的AUC可達0.94（95%CI：0.88–0.99），優于單一指標（NFL AUC=0.86，GFAP AUC=0.82）。

4. 討論

損傷軸索釋放的結構蛋白（NFL、NEFM、MBP）可直接反映軸索損傷程度，而星形膠質細胞活化標志物（GFAP、S100B）則體現繼發性神經炎癥反應。本研究結合iTRAQ定量結果與聚類網絡分析，不單純依賴差異倍數，而是從網絡調控角度篩選出更穩定的標志物組合。

WGCNA模塊與GCS評分的高度關聯提示，軸索運輸和突觸信號通路相關蛋白的協同下調可能是DAI后意識障礙的分子基礎。PPI網絡中的Hub蛋白不僅具有診斷價值，還可能作為潛在治療靶點。其中UCHL1和ENO2此前在TBI中報道較少，但其在本研究網絡中處于連接節點位置，值得進一步驗證。

本研究存在一定局限：樣本量有限，且腦脊液與血清標志物濃度可能存在差異；iTRAQ標記的批間效應可能影響低豐度蛋白的定量準確性。未來的方向應包括PRM/MRM靶向驗證以及多中心大樣本隊列的外部驗證。

5. 結論

通過iTRAQ定量蛋白質組學聯合WGCNA和PPI聚類網絡分析，本研究篩選出以NEFL、NEFM、GFAP、S100B、UCHL1、ENO2、SYN1為核心的DAI候選生物標志物網絡，為DAI的早期診斷、病情監測及分子機制研究提供了新的視角和實驗依據。該策略亦可推廣至其他創傷性腦損傷亞型的標志物篩選研究。

參考文獻

[1] Blennow K, Brody DL, Kochanek PM, et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2016;2:16084.
[2] Wang KK, Yang Z, Zhu T, et al. An update on diagnostic and prognostic biomarkers for traumatic brain injury. Expert Rev Mol Diagn. 2018;18(2):165-180.
[3] Langfelder P, Horvath S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008;9:559.
[4] Szklarczyk D, Gable AL, Lyon D, et al. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage. Nucleic Acids Res. 2019;47(D1):D607-D613.
[5] Thelin EP, Nelson DW, Bellander BM. A review of the clinical utility of the PTSD and DAIs biomarkers. Front Neurol. 2017;8:585.